Aktywność star enzymów restrykcyjnych
Aktywność star to cecha enzymów restrykcyjnych, która polega na zmniejszeniu lub całkowitym zaniku ich specyficzności działania. Przejawia się to w postaci cięcia DNA w miejscach, które nie są zgodne z pierwotnymi sekwencjami restrykcyjnymi. Wraz z obniżeniem specyficzności, enzymy zaczynają przecinać sekwencje, które coraz bardziej odbiegają od oryginalnych miejsc cięcia. Zjawisko to zostało nazwane w odniesieniu do alternatywnej aktywności, oznaczanej symbolem * (np. EcoRI* zamiast EcoRI). Obecnie dostępne są rekombinowane enzymy, które mają zmniejszoną lub nawet wyeliminowaną aktywność star.
Najczęstszy przypadek zmniejszenia specyficzności dotyczy cięcia sekwencji, które różnią się od restrykcyjnej jedynie jednym nukleotydem, a także sekwencji, które są krótsze o kilka nukleotydów na początku.
Na wystąpienie aktywności star w reakcjach z udziałem enzymów restrykcyjnych wpływa wiele czynników, chociaż każdy z nich działa z różną intensywnością, a ich wpływ zależy od konkretnego enzymu. Na przykład, EcoRI jest bardziej wrażliwy na wyższe stężenie glicerolu niż na podwyższone pH. Do czynników wpływających należą:
- wysokie stężenie glicerolu (często stosowanego w buforach do przechowywania enzymów);
- nadmiar enzymu w stosunku do ilości DNA;
- niska siła jonowa (<25mM);
- wysokie pH (>8,0);
- obecność odczynników organicznych (takich jak DMSO, etanol, glikol i inne);
- zamiana jonów Mg2+ na inne jony metali dwuwartościowych: Mn2+, Cu2+, Co2+, Zn2+.
Aktywność star zazwyczaj jest zjawiskiem niepożądanym, które może wprowadzać trudności i zmienność do prowadzonych eksperymentów. Problem ten staje się szczególnie widoczny, gdy stosuje się kilka enzymów restrykcyjnych w tym samym czasie (cięcie wielokrotne), co utrudnia zapewnienie optymalnych warunków dla każdego z nich.
Aby zredukować aktywność star, warto stosować się do wskazówek producenta enzymów, takich jak:
- używanie enzymu w minimalnej ilości koniecznej do cięcia danej ilości DNA (co zmniejsza ilość glicerolu w próbce i zapewnia odpowiedni stosunek enzymu do DNA, aczkolwiek wydłuża czas reakcji);
- usunięcie śladów odczynników organicznych (zwłaszcza etanolu, który często stosuje się do izolacji DNA);
- zapewnienie odpowiednio wysokiej siły jonowej lub jej specjalnego zwiększenia (choć niektóre enzymy mogą być inhibowane przez zbyt wysoką siłę jonową);
- utrzymywanie pH reakcji w okolicach 7,0 (wyższe pH może być wynikiem użycia zanieczyszczonego DNA izolowanego metodą lizy alkalicznej);
- stosowanie Mg2+ jako jonów dwuwartościowych wspierających pracę enzymu oraz unikanie zanieczyszczeń innymi jonami.
Przypisy
Bibliografia
Star Activity (relaxed or altered specifity). New England Biolabs, Inc.. [dostęp 2018-08-11].
Loading ...