Agar czekoladowy

Agar czekoladowy (CHOC; ang. chocolate agar) to nieselektywna pożywka mikrobiologiczna, która zawiera zlizowaną krew, wzbogacając ją w NAD, hem i inne składniki odżywcze. Ta specjalna pożywka jest używana do hodowli wybrednych szczepów bakterii.

Mimo swojej nazwy nie zawiera ona czekolady; określenie to pochodzi od czekoladowego koloru, który jest wynikiem obecności zhemolizowanych erytrocytów.

Historia

Na początku XX wieku nie było idealnej pożywki do hodowli bakterii o wysokich wymaganiach odżywczych, takich jak gonokoki. Stosowano różne podłoża, w tym węglan sodu, cielęcinę, albuminy, brzeczkę piwną, serwatkę, sacharozę, mocz, wyciąg z jąder lub jajek, ale wyniki były niezadowalające. W 1910 roku Cohen i Fitzgerald opracowali krwawy agar czekoladowy, który został użyty do hodowli Haemophilus. W 1927 roku McLeod stworzył podłoże, które po raz pierwszy umożliwiło udaną hodowlę gonokoków. W latach 30. XX wieku agar czekoladowy przygotowywano poprzez podgrzewanie agaru z krwią; wcześniej stosowano ogrzewanie wyciągu z mięsa.

Jednym z problemów związanych z tym podłożem był wzrost bakterii będących częścią flory fizjologicznej; na przykład przy posiewie w kierunku gonokoków często rozwijał się Proteus mirabilis. Dopiero wprowadzenie ristocetyny i polimyksyn w 1964 roku, a następnie wankomycyny i nystatyny w 1967 oraz trimetoprymu w 1970 roku, pozwoliło rozwiązać problem bakterii komensalnych.

Skład

W skład agaru czekoladowego wchodzą:

agar-agar;
pepton;
mąka kukurydziana;
K2HPO4;
KH2PO4;
oryginalnie krew, najczęściej owcy, przy czym jakość pożywki czekoladowej zależy od źródła krwi (koza, baran, owca, świnia); obecnie niezbędne substancje (hem, NAD itp.) są dodawane osobno;
ewentualne dodatki (patrz sekcja warianty).

Przygotowanie

Pożywkę przygotowuje się przez wielokrotne podgrzewanie i schładzanie agaru z krwią w łaźni wodnej w temperaturze 100 °C oraz pod wyższym ciśnieniem. Po pewnym czasie uzyskuje się jednolite zabarwienie, co oznacza hemolizę krwinek czerwonych (istnieje wiele protokołów z różnymi czasami ogrzewania i temperaturą). W przypadku przygotowania pożywki z krwi świni temperatura musi być nieco wyższa. Krew kozy zawiera inhibitor wzrostu, który wpływa na Haemophilus, co wymusza wydłużenie czasu ogrzewania do 15 minut, aby go zneutralizować. Dodatek NAD do nieogrzewanej pożywki nie neutralizuje tego efektu.

Po wysterylizowaniu i wymieszaniu pożywka jest rozlewana do odpowiednich naczyń hodowlanych (np. szalek Petriego).

Obecnie, w produkcji CHOC, czynniki niezbędne do wzrostu (NAD, hemoglobina i inne) są dodawane osobno, co eliminuje potrzebę dodawania krwi i lizy erytrocytów.

Zastosowanie

Agar czekoladowy ma tę zaletę, że sprzyja wzrostowi wymagającym bakteriom, takim jak Haemophilus, Neisseria oraz Moraxella, które nie rozwijają się na standardowych pożywkach. Gatunki te nie produkują hemolizyn, które niszczą erytrocyty, a równocześnie wymagają związków obecnych w ich wnętrzu. Dlatego ich wzrost jest możliwy dopiero po uszkodzeniu erytrocytów (lizie) poprzez ich ogrzanie. Niskie stężenie agaru zapewnia także odpowiednią wilgotność niezbędną do wzrostu. Podłoże to jest stosowane do hodowli bakterii tlenowych lub fakultatywnych beztlenowców. Na agaru czekoladowym, podobnie jak na agaru krwawym, rozwijają się paciorkowce i gronkowce.

Agar czekoladowy to najlepsze podłoże do hodowli Bartonella henselae (obok agaru z krwi króliczej) oraz Eikenella corrodens.

Wyniki odczytuje się zazwyczaj po 48 godzinach (18–24 godziny w przypadku gonokoków).

Krew

Agar czekoladowy jest rutynowo stosowany podczas posiewu krwi w przypadku podejrzenia bakteriemii lub infekcyjnego zapalenia wsierdzia.

Płyn mózgowo-rdzeniowy

W przypadku podejrzenia zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych konieczne jest wykonanie posiewu na agarze czekoladowym, ponieważ dwoinka zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych nie rozwija się na innych podłożach.

Plwocina

Agar czekoladowy z bacytracyną jest używany przy posiewie plwociny.

Żółć

Rutynowe posiewy żółci na agarze czekoladowym nie są zalecane, chyba że preparat bezpośredni będzie charakterystyczny dla Haemophilus.

Mocz

0,27% przypadków zakażeń układu moczowego spowodowane jest przez Haemophilus, a w grupie dzieci ten wskaźnik wzrasta do 0,88%. Dlatego zaleca się posiew moczu na agar czekoladowy przynajmniej u dzieci, choć nie jest to wymóg.

Posiew z tkanek

Agar czekoladowy jest wykorzystywany przy posiewach w przypadku zapaleń tkanek głębokich, na przykład tkanki łącznej, zapalenia ucha oraz szpiku u dzieci. W przypadku wymazu z oka zawsze należy wykonać posiew także na agarze czekoladowym.

Agar czekoladowy nie jest zalecany przy posiewie bioptatów żołądka, ponieważ inne rutynowo stosowane podłoża zapewniają efektywniejszy wzrost Helicobacter pylori.

Hodowla grzybów

Podłoże to nie jest stosowane w diagnostyce zakażeń grzybiczych, jednak wzrastają na nim liczne grzyby. W badaniu porównawczym pięciu podłóż (w tym Sabourauda) najszybszy wzrost grzybów uzyskano na agarze czekoladowym. Wyjątkiem jest Histoplasma capsulatum, który nie rozwija się; może to wynikać z faktu, że wzrost tych grzybów na agarze z krwi jest dłuższy, a metodologia zakładała hodowlę podłóż krwawych jedynie przez 3 dni. Dlatego z powodu H. capsulatum nie zaleca się ograniczania tradycyjnych podłoży w kierunku grzybów.

Badanie oporności

Badanie oporności prątków gruźlicy za pomocą E-testów nie powinno być przeprowadzane na agarze czekoladowym ze względu na długi czas oczekiwania na wyniki (21 dni); agar krwawy zapewnia krótszy czas oczekiwania (10 dni) i to on powinien być stosowany, jeśli laboratorium nie dysponuje podłożem Middlebrooka 7H11.

Ograniczenia

Wadą pożywki jest to, że na agarze czekoladowym rozwijają się praktycznie wszystkie bakterie z pobranego biomateriału, co uniemożliwia posiew na przykład z kału. Dlatego, jeśli to możliwe, wykorzystuje się inne podłoża, na których może wyrosnąć tylko jeden rodzaj bakterii.

Nie można ocenić strefy hemolizy wokół kolonii (w przeciwieństwie do agaru z krwią); występuje jednak zmiana zabarwienia, jeśli szczepy bakterii produkują peroksydazę.

Warianty

Isovitalex

Wersja agaru czekoladowego wzbogacona o składnik isovitalex (IVX), będący źródłem dodatkowych cząsteczek NAD dla H. influenzae. Przyspiesza on nieznacznie wzrost na płytkach z agarem czekoladowym (kolonie bakterii w porównaniu do podłoża standardowego są większe o około 1 mm), jednak cena takiej pożywki jest dwa razy wyższa; dlatego nie jest preferowana przez część badaczy.

W skład dodatku isovitalex wchodzą glukoza, L-cysteina, L-glutamina, adenina, guanina, witamina B12, tiamina oraz NAD.

Witamina B6

Pożywka z dodatkiem witaminy B6 jest używana do hodowli niektórych paciorkowców.

Agar czekoladowy II

Głównym dodatkiem jest kazeina oraz inne źródło peptonu.

Antybiotyki

Antybiotyki są dodawane w celu selekcji niepożądanych szczepów (agar czekoladowy po ich dodaniu staje się z pożywki nieselektywnej pożywką selektywną).

bacytracyna – wybiórcza dla Haemophilus; zalecana dla posiewu z górnych dróg oddechowych (zanieczyszczenia florą fizjologiczną);
wankomycyna – hamuje wzrost bakterii Gram-dodatnich (oraz rzadko także poszukiwane N. gonorrhoeae). Można stosować zamiennie teikoplaninę lub linkomycynę;
kolistyna – hamuje wzrost bakterii Gram-ujemnych;
nystatyna – hamuje wzrost grzybów. Z uwagi na to, że niektóre szczepy Candida albicans są oporne na nystatynę, stosuje się zamiennie anizomycynę lub amfoterycynę B;
trimetoprym – hamuje wzrost bakterii z rodzaju Proteus.